Усовершенствованные плазмиды облегчат получение терапевтически значимых белков

Ранее ученые из лаборатории биоинженерии клеток млекопитающих ФИЦ Биотехнологии РАН разработали вектор, позволяющий синтезировать в клетках яичника китайского хомячка факторы свертывания крови VIII и IX в необычно больших количествах, а также фолликулостимулирующий гормон человека. Эти белки применяются в медицине для лечения гемофилии и болезней женской репродуктивной системы соответственно.

Однако полученные авторами векторные плазмиды были довольно большими по размеру (около 12 тысяч пар нуклеотидов), что негативно отражалось на их способности встраиваться в геном клеток. Поэтому в новой работе исследователи попытались уменьшить векторную плазмиду, удаляя из нее участки ДНК, окружающие промотор и терминатор гена два «балластных» участка, никак не влияющих на активность гена. В результате ученые получили 6 различных плазмид размером от 13 до 8 тысяч пар нуклеотидов.

Чтобы проверить стабильность усовершенствованных плазмид, исследователи встроили в них ген зеленого флуоресцентного белка, по свечению которого можно точно отслеживать, как работает плазмида в клетке. Затем полученные конструкции ввели в клетки яичника китайского хомячка, селекцией отобрали такие клетки, в которых плазмида встроилась в геном и затем размножили копии встроенных плазмид при помощи геномной амплификации.

Наблюдения в течение 80 дней за отобранными клетками показали, что наработка встроенного в плазмиду белка сохраняется длительное время, при этом активность его синтеза несколько уменьшается для всех вариантов плазмид, но намного сильнее (в 3 раза) падает для плазмиды, в которой удалены все регуляторные участки ДНК перед самим промотором EEF1A1 Такая же низкая стабильность работы целевого гена фиксировалась для широко распространенных в биофармацевтике контрольных плазмид с вирусным промотором CMV. Среди укороченных плазмид с промотором EEF1A1 была отобрана такая, в которой целевой белок синтезировался на 20% быстрее, чем в исходной длинной плазмиде. Поэтому ее можно использовать для промышленной наработки терапевтически значимых молекул. Препарат этой векторной плазмиды был депонирован в международной коллекции Addgene и может бесплатно использоваться учеными. В России и Белоруссии препараты плазмиды для научных исследований могут быть получены у авторов статьи.

«Укороченные плазмиды перспективны в качестве векторов потому, что они так же хорошо, как и исходные длинные плазмиды сохраняются в клетках, но с них быстрее нарабатывается нужный белок. Так, наши эксперименты показали, что скорость синтеза целевого белка можно увеличить на 20%, просто удалив из плазмиды функционально незначимые последовательности. Сейчас мы уже применили новый вариант вектора для создания промышленного продуцента одного из гонадотропных гормонов и готовим материалы к публикации», — рассказывает Иван Воробьев, доктор биологических наук, заведующий лабораторией биоинженерии клеток млекопитающих ФИЦ Биотехнологии РАН.

Результаты исследования опубликованы в журнале PeerJ.