Ученые раскрыли механизм свечения фотопротеинов, применяемых в биотехе
Ученые из Долгопрудного, Красноярска и Дубны предприняли попытку разобраться в механизме свечения белка гидромедузы (фотопротеина), который широко используется при проведении биомедицинских анализов. Для этого были исследованы фотопротеины с мутациями, затрагивающими ключевые участки белковой молекулы. Мутантные белки не потеряли способности к биолюминесценции, однако изменили продолжительность и яркость свечения.
Светящиеся белки-фотопротеины из медузы Aequorea victoria и гидроида Obelia longissima — «рабочие лошадки» биотехнологов. Ключевой их особенностью является способность светиться голубым светом при взаимодействии с кальцием. После того как в 90-х годах XX века были обнаружены гены, ответственные за производство акворина и обелина, их использование в генной инженерии в качестве молекулярных светящихся сенсоров возрастало с каждым годом.
Поскольку реакция свечения фотопротеинов запускается повышением концентрации ионов кальция в цитоплазме, это может служить инструментом для исследования процессов клеточного деления, мышечных сокращений, передачи нервных импульсов, а также клеточной секреции. Фотопротеины, гены которых встраивались в различные организмы: от бактерий E. coli до млекопитающих, теперь помогают в изучении разнообразных событий, происходящих внутри клеток.
Тем не менее до сих пор не вполне ясна последовательность промежуточных стадий превращения субстрата фотопротеина в продукт реакции. Этот процесс превращения и лежит в основе реакции биолюминесценции. Чтобы его понять, ученым необходимо знать строение активного центра белка. В своей предыдущей работе, посвященной обелину, биофизики из МФТИ и Института Биофизики СО РАН с коллегами исследовали особенности его свечения в комплексе с химически измененным искусственным субстратом фотопротеина. Продолжая исследования, ученые решили на этот раз переключить внимание на активный центр самого белка. Для этого с помощью генной инженерии была произведена замена нескольких нуклеотидов в гене фотопротеина, встроенного в E. coli.
«Мы использовали кишечную палочку для производства “мутантных” версий акворина и обелина. Так нам удалось получить фотопротеины, в активном центре которых не присутствует молекула воды — ее наличие считается критически важным для протекания реакции», — поясняет Павел Наташин, кандидат биологических наук научный сотрудник лаборатории фотобиологии Института биофизики КНЦ СО РАН.
Эксперименты показали, что сами по себе замены не слишком влияют на свечение белка, хотя некоторые из них ухудшают его параметры, например интенсивность. Вода, как и предполагалось, играет ключевую роль, взаимодействуя с остатком аминокислоты His64. Вместе они выполняют функцию «катализатора», передающего протоны от растворителя к субстрату белка. Последний переходит в нейтральную форму, чей распад затем может обеспечить наибольший световой выход.
«Рациональное проектирование — это один из методов в инженерии белков, когда ученые пытаются создавать белки с улучшенными свойствами, основываясь на их трехмерной структуре и взаимосвязи между структурой и функцией. Проделанная нами работа как раз позволяет увидеть такую взаимосвязь и более осмысленно подходить к задачам создания белков с желаемыми характеристиками», — заключает Валентин Борщевский, заместитель директора Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ.
