Лаборатория генетики опухолевых клеток

Проект актуален для фундаментальной науки и для биомедицинских применений. Наиболее эффективные подходы в лечении онкологических заболеваний основаны на одновременном воздействии сразу на несколько мишеней или сигнальных путей клетки. Такой подход к мультитаргетной терапии объясняется большим количеством молекулярных повреждений опухолевой клетки, а также гетерогенностью опухоли. Мультитаргетная терапия может реализовываться через воздействие на главную мишень клетки – ДНК. Поэтому, в настоящее время, сохраняется интерес к созданию лекарств, направленных на повреждения функций ДНК в опухолевых клетках. Исследования нековалентных взаимодействий малых молекул с узкой бороздкой ДНК остаются актуальной областью поиска новых потенциальных терапевтических соединений. Однако, ДНК-повреждающие агенты имеют серьезное ограничение в клиническом применении вследствие их генотоксичности, из-за риска возникновения вторичных злокачественных опухолей. Поэтому наиболее перспективными считаются низкомолекулярные соединения, способные нековалентно и сайт-специфично связываться с узкой бороздкой двухцепочечной ДНК (ДНК) - узкобороздочные лиганды, не вызывая ее повреждений и, как следствие, ингибировать транскрипцию, модулировать сигнальные пути, и таким образом приводить к гибели опухолевой клетки. Новизна проекта заключается в изучении биологической, в том числе противоопухолевой активности уникальных флуоресцентных мономерных и димерных бисбензимидазол-пирролов новой серии DB2Py(n). Будет доработан и опубликован 15-ти стадийный синтез серии DB2Py(n). Предполагается расширить число новых соединений внутри серии для выбора наиболее активного соединения, с оптимальным размером линкера (n), и синтезировать новые бисбензимидазолы DB2Py(n). Это позволит более точно отобрать биологически активную молекулу. Лидерные соединения DB2Py(n) будут синтезированы в препаративных количествах. Общая методология настоящего исследования биологической активности соединений заключается в изучении in vivo и in vitro: в бесклеточной и клеточной моделях, а также на лабораторных животных. Полагаем, что такой подход позволит более полно охарактеризовать новые соединения и оценить их перспективность. Предполагается исследовать антипролиферативные свойства новых соединений как на панели различных опухолевых линий человека, так и на первичных, полученных из операционного материала пациентов с диагнозом глиобластома, изучить взаимодействия новых соединений с ДНК, ДНК- и РНК-зависимыми ферментами (топоизомеразы I и II, ДНК-полимераза, ревертаза). Малые молекулы связываются с хроматином клетки, изменяя конформацию ДНК и дестабилизируя нуклеосомы. Предполагается провести исследование влияния новых веществ на гистоновый шаперон FACT в клетке и в частности на субъединицы SSRP1 и SPT16 и ответить на вопрос “Существует ли прямая корреляция между цитотоксичностью и ингибированием FACT?”. Отдельный блок экспериментов позволит нам изучить мутагенность, генотоксичность и противоопухолевую активность in vivo. Полученные результаты позволят оценить потенциальную перспективу использования новых мономерных и димерных бисбензимидазол-пирролов в качестве противоопухолевых лекарств.

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) продолжает быть серьезным барьером на пути успешной химиотерапии опухолей, в том числе, множественной миеломы (ММ). Р-гликопротеин (Р-gp, ABCB1) - один из ключевых белков, отвечающих за формирование МЛУ опухолевых клеток Р-gp экспрессируется на поверхности клеток, занимаясь выбросом различных соединений, в том числе противоопухолевых препаратов. Ранее было продемонстрировано, как зарубежными авторами, так и в нашей лаборатории, что протеасомный ингибитор второго поколения карфилзомиб (cfz), применяемый при терапии рефрактерной ММ, приводит к увеличению экспрессии Р-gp. Наши результаты показали, что cfz взаимодействует с Р-gp, а также, что обработка устойчивых клеток ММ ингибитором P-gp сенсибилизирует их к действию cfz. Но существует известная проблема, что ни один из разработанных ингибиторов Р-gp не нашел свое место в клинической практике либо из-за неэффективности, либо из-за серьезной токсичности. Тогда одним из вариантов снижения экспрессии P-gp в клетках может стать ингибирование сигнальных путей, приводящих к его активации. Здесь возможно перепрофилировать уже использующиеся в клинике низкомолекулярные ингибиторы киназ. Однако молекулярные механизмы и сигнальные пути, которые ведут к увеличению экспрессии P-gp в клетках ММ, устойчивых к карфилзомибу не исследованы в достаточной мере. Решению этой научной проблемы мы планируем посвятить наш проект. В рамках проекта предполагается разделить с помощью клеточного сортера P-gp-негативную и P-gp-позитивную субпопуляцию из 3 клеточных линий, отличающихся по устойчивости к карфилзомибу: АМО-1, АМО-1/CFZ 1(устойчивость в 10 раз), АМО-1/CFZ 2 (устойчивость в 100 раз). Далее эти 6 субпопуляций, а также устойчивые к бортезомибу AMO-1/BTZ и иксазобиму AMO-1/IXZ будут отправлены на РНК-секвенирование. По результатам секвенирования с последующей верификацией результатов с помощью ПЦР в реальном времени и вестерн-блотом будут выявлены 1-2 сигнальных пути, которые наиболее вероятно приводят к гиперэкспрессии Р-гликопротеина. На последнем этапе будут проведены эксперименты по подавлению активности данных путей и оценка экспрессии Р-гликопротеина и чувствительности клеток к карфилзомибу. Будет проведен поиск препаратов, которые ингибируют эти пути, и уже применяются в клинической практике, чтобы в последующем иметь возможность перепрофилировать их использование.