Центральная научно-исследовательская лаборатория

Исследование относится к медицине, а именно к иммунологии, патофизиологии и экспериментальной медицине, и может быть использовано для обнаружения морфологических эквивалентов этапов формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ). Выделенную на двойном градиенте плотности раствора фиколла-верографина взвесь нейтрофилов после стимуляции смесью Lactobacillus reutri, L. acidophilius, L. rhamnosis и Bifidumbacterium longum суправитально окрашивают с использованием интеркалирующего красителя йодида пропидия и инкубируют под покровным стеклом в темноте в течение 5 минут при 37°С с моноклональными антителами к специфическому для нейтрофилов антигену CD15, мечеными флуоресцентным красителем FITC. Результаты визуализируют с помощью люминесцентной микроскопии, используя возбуждающий светофильтр с диапазоном длин волн 450-480 нм и эмиссионный - в диапазоне длин волн 515-700 нм. Подсчитывают морфологические эквиваленты клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции: интактные клетки ярко-зеленого цвета без прокрашенного ядра, слабоактивированные клетки с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и слабопрокрашенным ядром, активированные клетки с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и красно-оранжевым ядром, гиперактивированные клетки - поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром, достигающим границы цитолеммы, гиперактивированные клетки с начальными признаками нетоза - ранний нетоз - с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром с визуализируемым выходом ядерного вещества хотя бы в одной локации. Одномоментно с клеточными эквивалентами подсчитывают два варианта нетоза: нитевидный нетоз - красно-оранжевые структурированные нитевидные НВЛ, превышающие размер клетки более чем в 2 раза, облаковидный нетоз - неструктурированные гомогенные НВЛ красно-оранжевого цвета, расположенные вокруг клетки-источника, превышающие размер клетки в 1,5-2 раза. Отдельно подсчитывают количество микроорганизмов, находящихся непосредственно в нейтрофильных ловушках в пересчете на одну сеть с последующим расчетом процентного соотношения разных групп морфологических элементов - морфологический профиль нетоза. Способ обеспечивает не только возможность идентификации жизнеспособных (интактных) нейтрофилов, но и определения морфологических эквивалентов клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции, раннего нетоза и возможном выявлении экспрессированных на их поверхности специфических антигенов дифференцировки лейкоцитов с одновременной визуализацией НВЛ за счет двухцветной окраски препарата - структуры ярко-зеленого цвета (CD15-FITC) и прокрашенные йодидом пропидия нити ДНК красно-оранжевого цвета, позволяющей одномоментно определить нейтрофилы путем их иммунофенотипирования с визуализацией экспрессированных на поверхности дифференцировочных антигенов лейкоцитов (CD15), оценить их жизнеспособность и визуализировать нейтрофильные ловушки разного типа.