Нуклеотиды смогли определить коронавирус в слюне точнее и быстрее, чем ПЦР

Пандемия COVID-19 за три года унесла жизни более 6,8 миллионов человек, при этом вирус был выявлен почти у каждого десятого жителя планеты. Но далеко не все (особенно в начале пандемии) проходили тестирование на наличие вируса из-за высокой стоимости и длительного времени анализа. Чтобы уменьшить риск развития тяжелого течения заболевания, а также замедлить распространение коронавируса, необходимы быстрые и точные методы диагностики, которые позволят выявлять инфекцию на самых ранних стадиях. Наиболее часто тест на COVID-19 проводят с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая позволяет обнаружить в образцах слизи из носоглотки гены нескольких вирусных белков. Однако такая процедура довольно дорогая и длительная — анализ занимает несколько часов.

Уже в первые дни пандемии китайские ученые предложили использовать для диагностики аптамеры — искусственно синтезированные короткие нуклеотидные последовательности. Эти молекулы к тому моменту уже использовались при разработке средств диагностики, лекарств против рака и некоторых наследственных заболеваний. Аптамеры работают по схожему с антителами принципу: они прочно связываются с антигеном, в случае COVID-19 — с вирусными белками, поэтому их можно использовать в качестве «маркеров» для выявления инфекции. Удобной мишенью для аптамеров служит N-белок в оболочке коронавируса, поскольку в нем крайне редко происходят мутации, по сравнению, например, с шиповидным S-белком, который распознается человеческими антителами. Однако до сих пор данный метод не использовался повсеместно из-за того, что механизмы взаимодействия N-белка и аптамеров оставались недостаточно понятными, а это не позволяло найти наиболее эффективные последовательности для связывания с патогеном.

Ученые из Федерального исследовательского центра «Красноярский научный центр СО РАН» (Красноярск), Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого (Красноярск) и Сибирского федерального университета (Красноярск) с коллегами из Канады подобрали такие аптамеры, которые имеют максимально возможное сродство, то есть способность связываться, с N-белком коронавируса. Сначала авторы синтезировали множество коротких цепочек — длиной всего в 60 нуклеотидов — со случайным набором этих «букв». Затем специальную подложку с закрепленным на ней N-белком на время поместили в раствор с нуклеотидными последовательностями. Далее подложку промыли, чтобы те последовательности, которые не прикрепились к N-белку, смылись, а связавшиеся с ним — остались. Процедуру повторили несколько раз, чтобы удалить те молекулы, которые слабо взаимодействовали с белком. В результате исследователи получили 16 аптамеров с наибольшим сродством к N-белку коронавируса.

Затем авторы проверили чувствительность и силу связывания аптамеров с целевым белком с помощью специального датчика, отслеживающего процесс их взаимодействия по электрическим характеристикам. Наилучшие результаты показали три молекулы, обозначенные как tNSP1, tNSP2 и tNSP3. Чтобы доказать, что аптамеры избирательно распознают только SARS-CoV-2, ученые провели аналогичные опыты с N-белком другого коронавируса — MERS. Все варианты связывали его примерно на 50% хуже, что, с одной стороны, говорит об их высокой избирательности (поскольку связалась только половина молекул), а с другой — указывает на родство SARS-CoV-2 и MERS, а также на схожесть в структуре их белков. Однако этого оказалось достаточно для того, чтобы однозначно различить эти вирусы.

По сочетанию двух признаков — силы связывания и избирательности — авторы выбрали лучший аптамер, которым оказался tNSP3. Далее его использовали для обнаружения коронавируса в образцах человеческой слюны, содержащей уханьский вариант коронавируса, а также варианты Дельта и Омикрон. Во всех случаях tNSP3 позволил определить N-белок в количествах, сопоставимых с чувствительностью ПЦР. При этом предложенный подход оказался почти в десять раз быстрее и дешевле.

«Вклад российской стороны в эту разработку очень важен, мы проанализировали механизмы связывания и рассчитали энергии взаимодействия аптамеров с белками коронавируса. Благодаря этому нам удалось усовершенствовать методику тестирования COVID-19 с помощью аптамеров. При использовании в клинической практике этот метод поможет ускорить проведение анализа. Однако в ближайшее время нам предстоит еще сравнить точность данного подхода с ПЦР, для чего потребуется масштабное исследование на большем количестве пациентов. Это уже наша вторая работа по созданию аптамеров к коронавирусу. В прошлой публикации, поддержанной этим же грантом РНФ, мы смоделировали с помощью суперкомпьютеров Межведомственного суперкомпьютерного центра аптамеры к S-белку, которые сейчас исследуются на наличие противовирусного эффекта», — рассказывает руководитель проекта, поддержанного грантом РНФ, Анна Кичкайло, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник и заведующая лабораторией цифровых управляемых лекарств и тераностики Федерального исследовательского центра «Красноярский научный центр СО РАН».