Лаборатория структурных исследований аппарата трансляции

Регуляция экспрессии генов транс-кодируемыми малыми регуляторными РНК (мрРНК) – динамично развивающееся направление молекулярной биологии. Методами биоинформатики (сравнительный анализ) и геномики (RNA-seq и др.) идентифицировано большое число мрРНК M. tuberculosis, однако только для некоторых из них достоверно подтверждено их функциональное значение. В большинстве бактерий важную роль в функционировании мрРНК занимают так называемые РНК-шапероны - белки, способствующие взаимодействию мрРНК с мРНК благодаря своей функции разрушать (плавить) вторичную структуру молекул РНК и обеспечивать непосредственный контакт двух РНК на поверхности белка. Функционирование РНК-шаперонов в целом ряде грам-отрицательных и грам-положительных бактерий активно исследуется, однако их возможное участие в регуляции экспрессии генов в микобактериях практически не изучено.

Проект направлен на решение одной из фундаментальных проблем молекулярной биологии это выяснение функции высоко консервативной и универсальной рибосома-зависимой ГТФазы LepA. В эукариотах LepA необходим для биогенеза жизненно-важных органелл – хлоропластов и митохондрий. Нарушение работы LepA ингибирует фотосинтез у растений и приводит к мужскому бесплодию у мышей или раковой трансформации клеток у человека с последующим агрессивным метастазированием, у бактерий выявляется достаточно неоднородный спектр эффектов. Отсутствие общих критериев объединения разнообразия вторичных эффектов, вызываемых нарушением функциональной активности LepA, не позволяет понять функцию этого белка. Мы предлагаем применить редкую, но довольно эффективную модификацию современной технологии рибосомного профайлинга – селективный рибосомный профайлинг для исследования бактериального LepA в трансляции, который ранее не был применен для изучения LepA, но успешно используется в лабораториях за рубежом в исследованиях трансляционных факторов. Такой подход позволит отобрать из клеток Escherichia coli рибосомные комплексы, ассоциированные с белком LepA. Сравнение рибосомного профилирования ∆lepA штамма и профилирование рибосом, отобранных с помощью антител к LepA, из клеток штамма дикого типа позволит нам обнаружить набор мРНК, чья эффективность трансляции действительно зависит от LepA и определить их особенности. Более того, селективный рибосомный профайлинг помогает определить стадии трансляции, которые проходят с участием интересующего белка путем картирования положения LepA-связанных рибосом на таких матрицах. Полученные результаты можно будет экстраполировать, и использовать для объяснения вторичных эффектов, вызываемых нарушением работы LepA в мышах, человеке и растениях. Поняв молекулярные механизмы работы белка LepA, можно разработать способы снижения вторичных эффектов, вызываемых его повышенной экспрессией в опухолях.

В данной работе мы планируем изучить один из важнейших аспектов жизни культурных растений, а именно их реакцию на вирусную инфекцию. Возникновение вирусоустойчивости растений и ее преодоление вирусом представляет собой постоянный эволюционный процесс. В случае культурных растений понимание этого процесса имеет огромное значение не только с точки зрения фундаментальной науки, но и непосредственно прикладное, т.к. фитопатогены вирусной природы представляют собой одну из наиболее значимых угроз продовольственной безопасности человечества. Несмотря на активные научные изыскания в данной области до сих пор нет четкого представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе формирования и преодоления вирусоустойчивости у растений. В качестве объекта исследований мы выбрали представителей семейства Пасленовых, к которым относится множество сельскохозяйственных культур, и Y вирус картофеля, который является одним из наиболее часто встречающихся и вредоносных вирусных патогенов для этих растений. Критически важным моментом развития вирусной инфекции в растительной клетке для Y вируса картофеля является взаимодействие белка VPg с кэп-связывающими белками eIF4E клетки-хозяина. Белок VPg представляет собой с функциональной точки зрения имитацию кэп структуры и ковалентно связан с вирусной мРНК. В ходе инициации трансляции мРНК вируса этот белок узнает и связывает фактор инициации трансляции 4E (eIF4E) растений. Без формирования такого специфичного и стабильного комплекса жизненный цикл вируса будет прерван. Следует отметить, что у растений существует несколько изоформ белков семейства eIF4E. С чем связано разнообразие eIF4E, до сих пор не вполне ясно. Вирус избирательно взаимодействует с одной из изоформ eIF4E. В процессе формирования устойчивости растением VPg может переключиться на использование другой изоформы растительного кэп связывающего фактора или компенсировать возникновение устойчивости появлением аминокислотных замен в своей последовательности. На данный момент отсутствует экспериментальная информация, позволяющая детально рассмотреть взаимодействие белков семейства eIF4E и VPg со структурной точки зрения на уровне изучения образующихся при этом межмолекулярных интерфейсов. Более того, такой информации крайне не хватает как для отдельно взятых растительных факторов, так и для вирусных белков. Биохимических данных, позволяющих провести исчерпывающий анализ специфичности и прочности образующихся комплексов, на данный момент тоже явно недостаточно. Именно эти пробелы и призвана заполнить данная работа. В результате выполнения проекта будет определен молекулярный механизм взаимодействия eIF4E представителей Solonaceae с VPg, а также получены генетически редактированные растения.

Проект направлен на изучение базовых процессов – регуляции экспрессии генов на уровне трансляции и биогенеза рибосом, исключительно важных для функционирования каждой живой системы (клетки или организма). Регуляция экспрессии генов с помощью малых регуляторных РНК (мрРНК) и белковых РНК-шаперонов широко распространена в патогенных бактериях и часто активируется при внешних стрессах (в том числе воздействие антибиотиков), регулирует экспрессию генов вирулентности, чувства кворума, формирования биопленок. Мы планируем впервые, на основе крио-ЭМ анализа комплексов, образующихся на различных этапах взаимодействия мРНК с мрРНК и РНК-шапероном Hfq, создать детализированную модель данного типа регуляции. Это позволит заполнить существующие пробелы в предлагаемых моделях и выявить новые возможные мишени для воздействия на экспрессию генов в бактериях, включая патогенные. Кроме того, с помощью крио-ЭМ анализа мы планируем выявить роль белка RimJ в биогенезе бактериальных рибосом на структурном уровне. Это поможет пониманию такого слабоизученного фундаментального процесса как биогенез рибосом, интегрировав новый обнаруженный белковый фактор созревания рибосом в сложную сеть участников этого процесса. Умение манипулировать биогенезом рибосом, жизненно-важным процессом клетки, может помочь в поисках мишеней для новых антибактериальных препаратов. С другой стороны, такие современные вызовы, как появление новых патогенных вирусов, регуляция экспрессии генов которых происходит почти исключительно на уровне трансляции, требуют получения новых знаний, в том числе структурных, об инициации трансляции у эукариот.