Лаборатория иммунохимии

Фосфатаза CD45 контролирует в лимфоцитах уровень фосфорилирования ряда рецепторов и сигнальных молекул и таким образом является важным регулятором процесса активации лимфоцитов. Однако что управляет активностью самого CD45 остается невыясненным до настоящего времени. На роль регулятора может претендовать так называемый «CD45 ассоциированный протеин» (CD45-AP). Этот белок образует надмолекулярный комплекс не только с CD45, но также взаимодействует с корецептором CD4 и киназой Lck. Имеются веские основания полагать, что белок CD45-AP выполняет в клетке какие-то важные, но пока неизвестные функции. Прежде всего, сама ассоциация CD45-AP с CD45, CD4 и Lck очевидно не является случайной, а отражает тесные взаимодействия между этими молекулами. Во-вторых, известно, что белок CD45-AP может фосфорилироваться, а это является указанием на его возможную регуляторную роль белка CD45-AP. В третьих, степень его фосфорилирования зависит от активации клетки. Целью проекта является выяснение функции молекулы CD45-AP. Протеин CD45-AP не принадлежит ни к одному известному семейству белков и не имеет гомологов. Доменная организация этого белка неизвестна, а функция не определена, поэтому в данном исследовании придется решать абсолютно новые научные задачи.

Целью проекта является не только разработка специфического лечения для аллергии на пыльцу берёзы, но и, впервые в мире, заложить фундамент для стратегий профилактики и иммунности для предотвращения развития аллергии в течение школьного возраста.

Моноклональные антитела доказали свою эффективность при лечении ряда онкологических и аутоиммунных заболеваний. В настоящее время терапевтические антитела человеческого происхождения получают методом фагового дисплея или с помощью гибридомной технологии с использованием мышей, трансгенных по Ig человека. Однако эти подходы являются либо трудоемкими, либо труднодоступными, что ограничивает спектр генерируемых антител. Проблему быстрого получения терапевтических антител можно решить, если найти эффективный способ иммортализации В-лимфоцитов человека in vitro. Известно, что клоны Т-лимфоцитов человека легко получить в присутствии интерлейкина 2 и антиген-представляющих клеток, нагруженных целевым антигеном. Попытки заставить В-лимфоциты человека пролиферировать в культуре in vitro предпринимались давно, например, с помощью вируса Эпштейн-Барр в сочетании с лигандами толл-подобных рецепторов TLR-7 и TLR-9 (Lanzavecchia 2018). Несмотря на определенные успехи в этом направлении, пролиферативный потенциал В-клеток человека остается ограниченным. Недавно Kwakkenbos с соавт. (2016) продемонстрировал, что интерлейкин 21 (IL21) в сочетании с молекулой CD40L, экспрессированной на поверхности фидерных клеток, индуцирует мощную пролиферацию В-клеток человека. В наших предварительных экспериментах мы обнаружили, что в этих условиях В-клетки активно делятся, секретируют Ig и приобретают фенотип активированных лимфоцитов, но примерно к 10 дню потенциал пролиферации снижается и лимфоциты гибнут путем апоптоза. Можно предположить, что совместное действие стимуляции и анти-апоптотического репрограммирования позволит преодолеть пролиферативный барьер. Для получения оверэкспрессии анти-апоптотических генов BCL-6 и BCL-XL мы будем использовать ленти- и/или ретровирусную доставку. Новизна проекта состоит в том, что в дополнении к известным стимулам IL21 и CD40L мы будем использовать фактор BAFF (B-cell activating factor), который селективно увеличивает выживаемость плазмобластов. Кроме того, мы создадим безфидерную систему активацию В-лимфоцитов. Для этого будет получен рекомбинантный белок CD40L, который через изолейциновый зиппер слит с Fc фрагментом Ig (Рис. 1, zajavka.pdf). Это позволит получить молекулу CD40L в гексамерной форме, что необходимо для ее эффективного действия вне фидерных клеток. Химерный CD40L-Fc, сорбированный на пластик, в присутствии растворимого IL21 будет стимулировать В-лимфоциты человека. Отсутствие фидерных клеток позволит упростить процедуру стимуляции и облегчить ранний отбор наиболее аффинных клонов. Таким образом мы сможем совместить стимуляцию с этапом клонирования и тестирования антиген-специфических В-лимфоцитов. Для получения антиген-специфических иммортализованных В-клонов из крови добровольцев, иммунизированных одной из разрешенных вакцин или переболевших инфекционным заболеванием, будут выделены плазмобласты, которые будут стимулированы и репрограммированы, как описано выше. Антигенная специфичность В-клеточных клонов будет охарактеризована в тестах иммуноферментного анализа, Вестерн блота и ELISpot с вакцинным антигеном. Методом высокопроизводительного секвенирования мы сравним репертуары вариабельных генов Ig до и после стимуляции. Это позволит ответить на вопрос о том, сопровождается ли IL21/CD40L стимуляция с процессом гипермутаций в генах Ig. Кроме того, в отобранных В-клеточных клонах методом секвенирования по Сэнгеру будут определены полные ДНК-последовательности сопряженных легких и тяжелых цепей Ig. Используя эти последовательности, можно будет производить антиген-специфические рекомбинантные антитела. В исследовании будут принимать участие три лаборатории, специализирующиеся в области иммунологии, молекулярной биологии и функциональной геномики. Итогом работы будет создание нового метода стимуляции и иммортализации В-лимфоцитов человека, что позволит в будущем легко получать терапевтически пригодные антитела полностью человеческого происхождения.

На данный момент получены терапевтические антитела ко всем известным штаммам коронавируса, включая «омикрон», и основной задачей является получение универсальных антител, которые будут узнавать все возможные варианты вируса. В S-белке, который необходим для попадания вируса в клетки человека, постоянно происходят замены, и таким образом вирус ускользает от уничтожения антителами, поэтому главной целью является получение антитела именно к тем участкам S-белка, которые остаются общими у всех вариантов вируса. Можно ожидать, что лекарства, созданные на основе таких антител, смогут успешно предотвратить заражение или тяжелое течение болезни у людей из групп повышенного риска: пожилых, онкобольных, людей с различными иммунодефицитами и т. д.

Для прогнозирования дальнейшего распространения COVID-19 необходимы знания о продолжительности иммунологической памяти к коронавирусным антигенам. Эффективность разрабатываемых вакцин также будет определяться устойчивостью иммунологической памяти против SARS-CoV-2. Приобретенный иммунитет складывается из трех компонентов: гуморальная, а также Т- и В-клеточная память. Все три компонента участвуют в создании и поддержании иммунологической защиты против SARS-CoV-2. Опубликованные данные, в основном касаются гуморальной иммунологической памяти на SARS-CoV-2. Они свидетельствуют о том, что память на уровне антител сохраняется по крайней мере в течении нескольких месяцев. Показано также, что Т-клеточный ответ на SARS-CoV-2 является вполне продуктивным. Наименее изученным остается вопрос об формировании и продолжительности В-клеточной памяти после перенесенной коронавирусной инфекции. В ряде публикаций были описаны В-клетки памяти, которые образуются вскоре после перенесенного COVID-19, однако в этих работах В-клетки памяти использовались исключительно как источник генов Ig для последующего получения терапевтических моноклональных антител. Вопросы формирования, а также продолжительности В-клеточной памяти в этих работах не рассматривались. Недавно нами было проведено исследование В-клеточного иммунитета в острой фазе SARS-CoV-2 инфекции. В исследование было включено более 100 пациентов с COVID-19. Нами было обнаружено, что В-клетки памяти активно образуются во время острой фазы SARS-CoV-2 инфекции. Было также показано, что В-клетки памяти при стимуляции способны дифференцироваться в антитело-секретирующие клетки, которые продуцируют вирус-связывающие и вирус-нейтрализующие антитела. Насколько нам известно, это первое исследование, в котором выполнено количественное определение SARS-CoV-2 специфических антитело-секретирующих клеток методом ELISpot. Полученные нами данные являются хорошей отправной точкой для изучения долговременной В-клеточной памяти после перенесенной коронавирусной инфекции. В проекте на протяжении 3 лет будет изучена динамика В-клеток памяти у пациентов, переболевших COVID-19. В первую очередь в исследование будут включены бывшие пациенты, для которых В-клетки памяти уже были определены во время острой фазы COVID-19. Тестирование В-клеток памяти будет осуществляться с помощью разработанного нами метода ELISpot с использованием в качестве антигена рекомбинантного поверхностного Spike белка из вируса SARS-CoV-2. Поскольку В-клетки памяти являются покоящимися лимфоцитами, то для стимуляции продукции антител мы будем активировать В-клетки in vitro в течении 7 дней с помощью агониста толл-подобного рецептора 9 или комбинацией IL-21/CD40L. Параллельно этому мы будем также определять вирус-связывающую и вирус-нейтрализующую активность сывороточных антител. Тестирование вирус-нейтрализующей активности будет проводится с помощью биобезопасной системы на основе лентивируса, псевдотипированного белком S из SARS-CoV-2. Динамику вирус-специфических В-клеток памяти мы сравним с кинетикой гуморальной иммунологической памяти. Антиген-специфические В-клетки памяти мы будем окрашивать коронавирусным Spike белком, коньюгированным с фикоэритрином. Антиген-специфические лимфоциты будут отсортированы и гены Ig будут секвенированы из одиночных клеток. Это позволит нам определить динамику репертуара В-клеточного рецептора. Проект будет осуществляться при тесной кооперации с клиникой ФНКЦ ФМБА, которая сейчас полностью перепрофилирована в инфекционный центр для лечения COVID-19. Полученные данные о В-клеточной иммунологической памяти помогут в построении эпидемиологической модели короновирусной инфекции, а также для ответа на вопрос о возможности реинфекции коронавирусом. Результаты проекта будут также важны для оценки эффективности разрабатываемых вакцин против SARS-CoV-2.